Вестерн-блот

Вестерн-блот (англ. Western blot) — широковживаний лабораторний метод, заснований на реакції антиген—антитіло, що застосовується для визначення специфічних протеїнів в екстрактах клітин або тканин, попередньо фракціонованих за допомогою гелевого електрофорезу та перенесені, в переважній більшості випадків, на нітроцелюлозну або PVDF-мембрану. Трансфер протеїнів з гелю на мембрану дозволяє інкубувати їх з певним антитілом та виконати подальшу візуалізацію отриманих бендів.[1]

Бенди протеїнів, візуалізовані на нітроцелюлозній мембрані при виконанні вестерн-блоту.

Інколи цей метод називають імунний блотинг.[2]

Історія

Вестерн-блот було винайдено Гарі Тоубіном (Harry Towbin), який працював у лабораторії Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research. Проте назва «вестерн-блот» була дана цьому методу іншим науковцем — W. Neal Burnette, за аналогією з саузерн-блотом — методом визначення послідовностей в ДНК за допомогою антитіл, що винайшов Едвін Саузерн; та нозерн-блотом — за допомогою якого можна визначити ділянки в РНК, який винайшов Джордж Страк в Стенфорді.

Методика вестерн-блоту

Приготування зразків білку

Протоколи виготовлення зразків можуть суттєво відрізнятись в залежності від того, чи є досліджуваний білок інтегральним або розчинним, чи є необхідність у збереженні нативної конформації білка тощо. Зазвичай тканину, з якої необхідно виділити білок, механічно гомогенізують у присутності потужних детергентів, таких як β-меркаптоетанол або Тритон Х-100. Обов'язковим кроком є також вимірювання загальної концентрації білка (за методом Лоурі або Бредфорда) та вирівнювання її в різних зразках шляхом розведення, що полегшує порівняння кінцевих результатів.

Електрофорез

Гелевий електрофорез дозволяє розділити протеїни на фракції, в залежності від їх молекулярної маси — важкі рухаються в гелі повільніше за легкі.

Трансфер

Наступним етапом вестерн-блоту є перенесення білків з електрофорезного гелю на носій, на якому їх можна специфічно помітити антитілами. Як носія зазвичай використовують мембрану, виготовлену з нітроцелюлози або PVDF. Для проведення трансферу використовується спеціальний пристрій, що має назву трансблотер. В ранніх версіях вестерн-блоту перенесення білків з гелю на мембрану забезпечувалось фільтрувальним папером, який клався у «сендвіч» з носіїв та тягнув на себе багатий на детергенти трансферний розчин за рахунок капілярних сил. Рушійною силою у процедурі трансферу є електричне поле.[3]

Візуалізація

Нітроцелюлозна та PVDF-мембрани є сильними сорбентами білків, тому перед їх інкубуванням з антитілами проводиться процедура блокування (на лабораторному жаргоні її також часто називають «забивкою») — обробка носія багатим на білок розчином, який зв'яжеться з вільними сайтами на поверхні мембрани і попередить неспецифічну сорбцію антитіл. Зазвичай як білковий розчин використовують знежирене молоко.

Після блокування мембрана інкубується з первинним антитілом, яке специфічно зв'язується з досліджуваним білком. Далі додається вторинне антитіло, мічене біотином, пероксидазою хріну або радіоактивною речовиною, за допомогою якого можна виконати візуалізацію отриманих бендів. При видачі результату дослідження йде висновок про наявність у досліджуваному субстраті специфічних антитіл до певних протеїнів мікроорганізмів, як то антитіл до білку p124 ВІЛ.

Примітки
  1. Towbin, H. et al. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Bd. 76(9), S. 4350-4354. PMID 388439 PDF[недоступне посилання з травня 2019]
  2. Діагностичні можливості імунного блотингу при бореліозі. В.С. Копча, Н. А. Васильєва, М. І. Шкільна та ін. (11.07.2016)
  3. Corley RB. (2005). A Guide to Methods in the Biomedical Sciences. Springer. с. 11. ISBN 978-0-387-22844-0.
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.