Аргінілгліциласпарагінова кислота

Для розшифрування сполуки використовується два підходи. Перший — визначення числа індивідуальних амінокислотних залишків й їх ідентифікація, другий — секвенування.

Для ідентифікації трьох амінокислот використовується інформація з спектрів ядерного магнітного резонансу ${\displaystyle \mathrm {{}^{1}{H},\,{}^{13}{C}\,DEPT,COSY,TOCSY,HMQC} .}$ Пептиди є хіральними молекулами. Усі метиленові групи діастереотопні, навіть групи гліцину (метиленова група у вільному гліцині є енантіотропною). Починати аналіз пептидів потрібно зі спектру ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} .}$ У двохвимірному варіанті ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} }$ відображає кореляції між усіма спінами спінової системи, а кореляції зі спінами поза системою відсутні. У трипептиді три окремі спінові системи, і вони знаходяться у спектрі ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} .}$Протон ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ із сигналом при 8,95 м.д. корелює із двома резонансами (3,96 та 4,13 м.д.), що виявляє спінову систему. Якщо екстраполювати цю інформацію на спектр ${\displaystyle \mathrm {HMQC} ,}$ то виявиться, що ці протонні резонанси корелюють із одним атомом вуглецю при 41,9 м.д. (тобто діастереотопною метиленовою групою). Ця амінокислота ідентифікується як залишок гліцину, а кореляція із протоном ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ амідної групи дозволяє зробити висновок, що залишок гліцину не є ${\displaystyle \mathrm {N} }$-кінцевим.

Інша спінова система стає очевидною, якщо почати із загальноприйнятого початку — сигналу при ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ 8,26 м.д. Є три кореляції з цим сигналом для усіх чотирьох фрагментів цієї спінової системи. Якщо знову перенести цю інформацію прямо у спектр ${\displaystyle \mathrm {HMQC} ,}$ можна знайти відповідні вуглецеві сигнали. Звичайно, кореляція із резонансом ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ відсутня. Сигнал протону при 4,41 м.д. корелює із резонансом атома вуглецю при 52,4, а спектр ${\displaystyle \mathrm {{}^{13}C\,\,DEPT} }$ підтверджує, що це сигнали 2,58 й 2,72 м.д., які корелюють із одним сигналом атома вуглецю при 38,6 м.д. Спектр ${\displaystyle \mathrm {{}^{13}C\,\,DEPT} }$ підтверджує, що це сигнал метиленової групи. Цей залишок ідентифікується як аспарагінова кислота, і знову можна зробити виновок, що це не ${\displaystyle \mathrm {N} }$-кінцевий залишок.

Аналіз останньої спінової системи починається з розгляду сигналу протону ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ при 7,35 м.д. Ця спінова система включає ще чотири протонних резонанси; спектр ${\displaystyle \mathrm {HMQC} }$ та спектри ${\displaystyle \mathrm {{}^{13}C\,\,DEPT} }$ вказують, що вони відповідають одній метиновій і трьом метиленовим групам. Таким чином, цей амінокислотний залишок є аргініном.

Спектр ${\displaystyle \mathrm {COSY} }$ можна використовувати для верифікації отриманих результатів, хоча необхідності у цьому немає. Спектри ${\displaystyle \mathrm {COSY} }$ та ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} }$ не є надлишковими й взаємно доповнюють одне одного принаймні у одному важливому аспекті. Хоча спектр ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} }$ відображає усі спіни у спіновій системі, він не відображає реальні спін-спінові взаємодії. Наприклад, оскільки протон ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ із сигналом при 8,26 м.д. (у залишку аспарагінової кислоти) відображає кореляцію лише із метиновою групою у спектрі ${\displaystyle \mathrm {COSY} }$, то можна із впевненістю сказати, що ця група ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ бере участь у пептидному зв'язуванні, а метинова група є α- або антисиметричним атомом вуглецю у амінокислотному залишку. Протон ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ із сигналом при 7,35 м.д., віднесений до залишу аргініну, корелює із усіма спінами у спектрі ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} }$, але виявляє спін-спінову взаємодію лише із метиленовою групою при 2,24 м.д. у спектрі ${\displaystyle \mathrm {COSY} }$. Це спостереження дозволяє зробити два висновки. По-перше, протон ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ не взаємодіє із α-атомом вуглецю агрініну і тому повинен відноситися до ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ гуанідінової групи, а не α-аміногрупи. По-друге, аргініновий залишок повинен бути ${\displaystyle \mathrm {N} }$-термінальним, оскільки у спектрах ${\displaystyle \mathrm {COSY} }$ та ${\displaystyle \mathrm {TOCSY} }$ немає кореляції між метиновим протоном та сигналом при 4,13 м.д. та протоном ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$.

Інтегральна інформація, отримана із спектрів ${\displaystyle \mathrm {{}^{1}{H},\,{}^{13}{C}\,DEPT,COSY,TOCSY,HMQC} }$, дозволяє виконати віднесення сигналів усіх протонів у спектрі ${\displaystyle \mathrm {{}^{1}{H}} }$ за винятком тих, які зазнають швидкого обміну (тобто протони карбоксильних груп й вільних аміногруп), та сигналів усіх не четвертинних атомів вуглецю у спектрі ${\displaystyle \mathrm {{}^{13}{C}} }$. Необхідності у віднесенні протонів, які швидко обмінюються, немає.

Що стосується секвенування, то потужними методами ядерного магнітного резонансу є ${\displaystyle \mathrm {HMBC,\,ROESY\,(NOESY)} .}$ Перший відображає дальні спін-спінові взаємодії ${\displaystyle \mathrm {{}^{1}H-{}^{13}{C}} }$ (через 2 зв'язки із ${\displaystyle \mathrm {{}^{2}J_{CH}} }$). Для рішення задачі секвенування цей експеримент відображає кореляцію між сусідніми амінокислотами, оскільки «бачить» через амідний (пептидний) карбоніл амідний протон ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$. Це дозволяє провести віднесення карбонільних груп.

Інший зв'язок між амінокислотними залишками встановлюється при аналізі взаємодії між протоном ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ аспарагінової кислоти й двома протонами ${\displaystyle \mathrm {H-2} }$ гліцину, який виявляється посередництвом NOE. У цьому випадку немає перекривання сигналів. Цікаво відзначити кореляцію через NOE у залишку аспарагінової кислоти між протоном ${\displaystyle \mathrm {N-H} }$ та лише одним з двох діастереотопних метиленових протонів (${\displaystyle \mathrm {H-3} }$). Ця селективна взаємодія вказує на заторможене обертання й дозволяє просторову диференціацію й віднесення сигналів двох діастереотопних протонів.[2]