Фарбування за Грамом
Фарбування за Грамом (або метод Грама) — емпірично виведений метод розрізнення бактерій за допомогою фарбування їх певним методом на дві великі групи: Грам-позитивні і Грам-негативні), що розрізняються хімічними та фізичними властивостями їх клітинної стінки.
Етимологія
Метод називається на честь його винахідника, данського науковця Ганса Хрістіана Грама (1853–1938), який розробив цей метод у 1884 році щоб розрізнити бактерії Pneumococcus і Klebsiella pneumoniae.
Використання
Фарбування за Грамом — одна з найкорисніших фарбувальних процедур у лабораторних дослідженнях в мікробіології. Процедура широко використовується як інструмент для розрізнення Грам-негативних і Грам-позитивних бактерій, що звичайно є першим кроком у визначенні ідентичності специфічного бактерійного зразка.
У медицині фарбування за Грамом виконується при аналізі крові або біопсії, коли підозрюється інфекція. Цей метод набагато швидший, ніж отримання чистої культури, і особливо важливий, коли визначення типу інфекції необхідно для прогнозу та вибору методу лікування. Наприклад, при діагностиці цереброспінальної рідини на менінгіт і рідини суглобів на септичний артрит.
При аналізі, наприклад, Коки і спороносні форми бактерій, а також дріжджі — грам-позитивні і забарвлюються в синяво-чорний (темно-синій) колір, більшість інших бактерій — грам-негативні і забарвлюються в червоний колір, ядра клітин еукаріот набувають яскраво-червоного кольору, а цитоплазма — рожевого.
Техніка проведення фарбування
Фарбування за Грамом відноситься до складного способу фарбування, коли на мазок впливають двома фарбниками, з яких один є основним, а інший — додатковим. Окрім фарбувальних речовин при складних способах забарвлення застосовують знебарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін. Для фарбування за Грамом частіше використовують барвники трифенілметанової групи: генціановий, метиловий фіолетовий або кристал віолет. Грам-позитивні (Грам (+)) мікроорганізми дають міцне з'єднання з вказаними барвниками і йодом. При цьому вони не обезбарвлюються при дії на них спиртом, унаслідок чого при додатковому забарвленні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку приєднаний фіолетовий колір.
Грам-негативні (Грам (-)) мікроорганізми утворюють з основними барвниками і йодом з'єднання, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби обезбарвлюються і потім забарвлюються фуксином, набуваючи червоного кольору.
Підготовка матеріалу для фарбування
Матеріал, що досліджується, розподіляють тонким шаром по поверхні ретельно знежиреного скла. Приготований мазок висушують на повітрі і після повного висихання фіксують.
Фіксація
При фіксації мазок закріплюється на поверхні скла, і тому при подальшому фарбуванні препарату клітини не змиваються. Крім того, убиті мікробні клітини забарвлюються краще, ніж живі. Розрізняють фізичний спосіб фіксації, в основу якого покладена дія високої температури на клітину, і хімічні способи, що передбачають застосування хімічних засобів, що викликають коагуляцію білків цитоплазми.
Фізичний спосіб фіксації: Скло з препаратом беруть пінцетом і плавним рухом проводять 2-3 рази над верхньою частиною полум'я пальника. Весь процес фіксації повинен займати не більше, ніж 2 с. Надійність фіксації перевіряють таким прийомом: вільну від мазка поверхню скла прикладають до тильної поверхні лівої кисті. При правильній фіксації скло повинне бути гарячим, але не викликати відчуття опіку (70—80 °С).
Хімічний спосіб фіксації: Для фіксації мазків застосовують метиловий спирт, ацетон, суміш Никіфорова (суміш етилового спирту 96% і наркозного ефіру в співвідношенні 1:1), рідина Карнуа (етилового спирту 96% — 60%, хлороформу 30%, крижаної оцтової кислоти 10%). Скло з висушеним мазком занурюють в склянку з фіксуючою речовиною на 10-15 хвилин і потім висушують на повітрі.
Процес фарбування
- На фіксований мазок наливають один з основних барвників на 2—3 хвилини. Щоб уникнути осаду фарбують через фільтрувальний папір.
- Зливають фарбу, акуратно видаляють фільтрувальний папір. Мазок заливають на 1—2 хв розчином Люголя або йодистим розчином, за Грамом (водний розчин йодиду калію і кристалічного йоду в співвідношенні 2:1) до почорніння препарату.
- Розчин зливають, мазок прополіскують 96° етиловим спиртом або ацетоном, наливаючи і зливаючи його, поки мазок не знебарвиться і рідина, що стікає, не стане чистою (приблизно 20-40-60 секунд).
- Ретельно промивають скельця в проточній або дистильованій воді 1—2 хв.
- Для виявлення грам-негативних бактерій препарати додатково фарбують фуксином або сафраніном (2—5 хв).
- Промивають в проточній воді і висушують фільтрувальним папером.
Посилання
- Gram, HC (1884). Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. Fortschritte der Medizin 2: 185–89.
- Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (вид. 9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
- Madigan, MT; Martinko J; Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (вид. 10th Edition). Lippincott Williams & Wilkins.
- Ryan, KJ; Ray, CG (2004). Sherris Medical Microbiology (вид. 4th ed.). McGraw Hill.
- Application of stains in clinical microbiology — резюме статьи в Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119–125(7)
- Глосарій термінів з хімії / уклад. Й. Опейда, О. Швайка ; Ін-т фізико-органічної хімії та вуглехімії ім. Л. М. Литвиненка НАН України, Донецький національний університет. — Дон. : Вебер, 2008. — 738 с. — ISBN 978-966-335-206-0.