Ретеплаза

Неглікозильований поліпептид масою 39,6 кДа. Cкладється з 355 амінокислотних залишків, що включає 1-3 та 176—527 залишків t-PA (тканинного активатора плазміногену людини). Включає 2 домени: kringle 2 та серин-протеазний.[5] На відміну від t-PA не має доменів: kringle -1, finger домену, та домену епітеліального фактору росту (ЕФР). Залишки серину, гістидину та аспартату формують каталітичний центр ферменту. Зближення гістидину, аспартату та серину забезпечується третинною структурою білка.[3]

Для отримання рекомбінантного препарату використали ген t-PA з бібліотеки клітин меланоми. Шляхом екзон-інтронної реорганізації гену були вилучені ділянки, що кодують домени kringle -1, finger, та ЕФР. Модифікована послідовність була включена у векторну плазміду pKK223-3. Вектор був включений в геном E. coli через трансформацію. Ретеплаза накопичується в клітинах E. coli у вигляді тіл включення. Для виділення ензиму культура клітин оброблялась лізоцимом. З отриманого лізату виокремлюється фракція з ретеплазою, що розчиняється за допомогою суміші гуанідин гідрохлориду та дітіоеритриту. Оскільки ретеплаза це рекомбінантний білок отриманий з бактерії E.coli, то він не проходить пост-трансляційних модифікацій серед яких: утворення дисульфідних зв'язків (всього 9) та глікозилювання.[4][6] Це і визначає необхідність ренатурації ферменту in vitro. Для відновлення структури ферменту застосовують розчин дисульфідів.

Для оптимізації процесу виробництва ретеплази застосували вектор pBAD/gIIIA, що кодував інформацію про білки екскреції ретеплази.[6] Це полегшило б процес очищення та виокремлення цільового ферменту оскільки робота проводиться з периплазмою та культуральним середовищем. Незважаючи на модифікований вектор, лише невелика частина ретеплази була виявлена поза клітиною.

Урокіназа, стрептокіназа та аністреплаза відносяться до фібрин неспецифічних тромболітиків. Це означає, що їх активність в крові визначається лише наявністю субстрату та концентрацією самого ферменту в крові. Таким чином тромболітики, що не специфічні до фібрину постійно активують плазмін, поза межами кров'яного згустка тим самим сповільнюючи тромболіз (плазмін активатори постійно насичені). Надмірна концентрація цих тромболітиків призводить до зменшення вмісту α1 — антиплазміну, основного інгібітора плазміну, і як наслідок, призводить до підвищення ризику кровотеч.[4]

Якщо порівнювати специфічні до фібрину активатори плазміну з ретеплазою, то остання має більш пролонговану дію. Ця властивість забезпечена видаленням ЕФР домену, що відповідальний за зв'язування зі специфічними рецепторами на поверхні гепатоцитів. Зв'язування з рецептором активує сигнальний каскад, що призводить до поглинання t-PA в клітину. Отже, ЕФР домен відповідає за зменшення концентрації t-PA в крові.[5]

Зміна в структурі оригінального гену t-PA вплинула не тільки на час дії ферменту. Kringle-2 та finger домени відповідають за зв'язування t-PA з фібрином. Видалення останнього призвело до зменшення спорідненості ретеплази до фібрину. Ця модифікація збільшила лабільність ретеплази та дозволила діяти не тільки на поверхні тромбу, а й всередині нього.[5]

Тромболітична дія застосовується при лікуванні таких хвороб:

• Гострий інфаркт міокарда
• Гострий ішемічний інсульт
• Легенева емболія

Можливе застосування при введенні судинних катетерів для збільшення їх провідності. Ретеплаза також інгібує АДФ індуковану агрегацію тромбоцитів.[5]