Цитоскелет прокаріот

MreB (англ. murein cluster B) та його гомологи — білки поширені серед бактерій, що мають паличкоподібну або спіральну форми, і відсутні у коків. Деякі бактерії, наприклад Escherichia coli та Caulobacter crescentus, містять тільки ген білка MreB, тоді як інші, зокрема Bacillus subtilis, крім нього мають також гени його гомологів Mbl (англ. MreB-like) та MreBH (англ. MreB homolog).[4] Ці білки забезпечують підтримання паличкоподібної форми клітини, її полярності, а також розходження копій бактерійної ДНК під час поділу.

In vivo білок MreB та його гомологи утворюють довгі спіральні філаменти розташовані вздовж бактерійної клітини, вони можуть об'єднуватись у міцні і досить гнучкі пучки. Такі філаменти є динамічними структурами, тривалість їх півжиття зазвичай не перевищує кількох хвилин. Окрім того у деяких видів, зокрема C.crescentus та Rhodobacter sphaeroides філаменти MreB змінюють своє розташування впродовж клітинного циклу: під час поділу вони концентруються у центральній частині клітини і утворюють кільце. Проте, оскільки мутанти із делецією гену mreB не втрачають здатність до цитокінезу, очевидно білок MreB не є необхідним для цього процесу.[1]

Як було показано в експериментах на білках бактерії Thermotoga maritima мономерні одиниці MreB здатні до самоорганізації in vitro у довгі лінійні філаменти, які складаються з двох протофіламентів розташованих паралельно. Отже за будовою філаменти MreB відрізняються F-актину, утвореного двома ланцюгами спірально закрученими один навколо одного. Для полімеризації MreB необхідна наявність у середовищі АТФ, проте вона відбувається однаково успішно і в присутності ГТФ (на відміну від актину, який полімеризується лише за наявності АТФ). Це пов'язано з тим, що нові субодиниці включаються до складу полімеру тільки у формі зв'язаній з нуклеотидтрифосфатом, пізніше відбувається гідроліз зв'язаного АТФ чи ГТФ до АДФ чи ГДФ відповідно.[1]

Схематичне зображення ролі філаментів MreB цитоскелету бактерій для підтримання паличкоподібної форми клітини: до цих філаментів, розташованих по спіралі, кріпляться ферменти синтезу пептидоглікану клітинної стінки, а саме муреїнтранспептидаза PBP2. В утворенні цього комплексу також беруть участь білки MreC (утворює спіральні філаменти у периплазматичному просторі), MreD, RodA та RodZ (трансмембранні білки)

Одною із основних функцій філаментів MreB та гомологічних білків є підтримання паличкоподібної або спіральної форми бактерійної клітини. Мутації, які порушуюють експресію цих білків, призводять до вираженої зміни форми бактерій (зазвичай, вони перетворюються в округлі клітини, або у випадку Mbl — у клітини неправильної форми). Проте філаменти MreB не слугують безпосередньо каркасом для підтримання форми клітини, натомість, розташовуючись по спіралі вздовж неї вони є сайтами для прикріплення ферментів, що синтезують пептидоглікан клітинної стінки. Таким чином вони регулюють характер відкладання нових елементів до оболонки бактерій, яка власне і є визначальним фактором у підтриманні сталої форми. Подібним чином мікротрубочки рослинної клітини впливають на її форму, направляючи включення молекул целюлози в клітинну стінку.[3] У багатьох бактерій (зокрема і в E.coli та B.subtilis) ген mreB є частиною оперону, до складу якого входять також гени mreC та mreD. Цей оперон входить до великого кластеру генів, необхідних для біосинтезу пептидоглікану. Продукти генів mreC та mreD — це білки внутрішньої мембрани грам-негативних бактерій, вони взаємодіють із білком MreB і беруть участь в організації його комплексу із ферментами, задіяними в біосинтезі муреїну, такими як муреїнтранспептидаза PBP2.[1] Також до складу цього комплексу входять трансмембранні білки RodZ та RodA.[5]

Філаменти MreB також беруть участь у визначенні деяких аспектів полярності клітини, зокрема концентрації на одному або обидвох полюсах деяких білків, наприклад тих, що відповідають за хемотаксис, рухливість, секрецію та вірулентність.

Ще однією функцією MreB та його гомологів є участь у розходженні копій бактерійної хромосоми під час поділу. Серед мутантів, в яких цей білок відсутній, були виявлені клітини із кількома нуклеоїдами в цитоплазмі, а також і клітини, що не мали хромосом. Місцем прикріплення білків MreB до бактерійної ДНК є точка oriC, приєднання відбувається або безпосередньо або за участі інших білків. Під час поділу філаменти цитоскелету забезпечують розходження точок oriC двох копій ДНК до протилежних кінців клітини, механізм цього процесу наразі (2006 рік) не з'ясований. Також невідомо яким чином відбувається розходження хромосом у коків, в яких відсутній ген mreB та його гомологи.[1]

Механізм розходження копій плазміди, що здійснюється за участі філаментів ParM

Багато малокопійних (~1-5 копій) плазмід бактерій мають спеціальні системи, що забезпечують їх розходження після реплікації. Ці механізми необхідні для того, щоб після поділу кожна з дочірних клітин отримала принаймні одну молекулу плазмідної ДНК. Відомо три типи систем, що забезпечують розходження малокопійних плазмід, у кожній з яких використовуються різні моторні білки (тип І — АТФази типу Walker A або ParA-подібні білки, тип ІІ — гомологи тубуліну або TubZ-подібні білки, тип ІІІ — гомологи актину або ParM-подібні білки). Білок ParM (від англ. partitioning motor) був вперше виявлений при дослідженні пламзіди R1 E.coli. Зараз ця система сегрегації плазмідної ДНК є найкраще вивченою.[6] Схожа система була виявлена і в інших плазмідах, зокрема тих, що відповідають за поширення стійкості до багатьох препаратів (англ. multidrug resistance).[3]

Як і всі елементи цитоскелету філаменти ParM складаються із мономерних білкових субодиниць. Ці субодиниці здатні до полімеризації in vitro у присутності АТФ або ГТФ. Утворені нитки складаються із двох протофіламентів, закручених один навколо одного (структура схожа до F-актину). У живих клітинах мономери ParM формують довгі нерозгалужені філаменти, які розміщуються вздовж осі бактерії. На відміну від актину та MreB і його аналогів ParM не утворює пучків.

Полімеризація та дисоціаця мономерів ParM залежить від приєднання та гідролізу АТФ. Нові субодиниці включаються до складу філаменту в АТФ-зв'язаній формі, при чому приєднання може відбуватись на обидвох кінцях філаменту. Одночасно із включенням нової ParM-АТФ субодиниці відбувається гідроліз АТФ в останній приєднаній білковій молекулі. Таким чином весь філамент складається із білків ParM-АДФ, і тільки на кінцях знаходяться ParM-АТФ субодиниці, які «кепують» всю структуру стабілізуючи її.

За відсутності відповідної плазміди полімеризація філаментів ParM триває поки вони не досягають певної критичної довжини. Після цього вони починають дуже швидко дисоціювати, при чому швидкість цього процесу приблизно у 100 разів перевищує таку для F-актину, тобто спостерігається так звана динамічна нестабільність, за якою ці елементи більше нагадують мікротрубочки еукаріот.[1][6]

Ген parM входить до локусу par плазміди R1, крім нього тут також міститься ділянка parC (від англ. centromere), що відіграє роль аналогічну до центромери в хромосомах еукаріот, а також ген parR, продукт якого ParR (від англ. repressor) приєднується до ділянки parC та здійснює ауторегуляцію транскрипції локуса par, а також слугує адаптером для приєднання білка ParM.

Після реплікації плазміди R1 до обидвох її копій у ділянці parC приєднується білок ParR. У такому стані він може зв'язувати та стабілізувати філаменти ParM, які постійно збираються і розбираються у цитоплазмі. Після цього полімерні нитки ParM починають видовжуватись, приєднуючи на кожному кінці нові мономери. Цей процес супроводжується гідролізом АТФ. Внаслідок видовження філаменту дві плазміди, що приєднані до його країв, розштовхуються в різні сторони аж поки не досягають полюсів клітини. Після цього відбувається дисоціація полімеру ParM.[1][6]

Ще один прокароітичний гомолог актину MamK бере участь в організації мембран магнетосом. Магнетосоми — це оточені мембраною органели бактерій родів Magnetospirillum та Magnetococcus, які містять кристали магнетиту і допомагають бактерії орієнтуватись у геомагнітному полі. У клітині магнетосоми розташовані в ряд, внаслідок чого вони можуть функціювати як голка магніту. Таке розташування забезпечується філаментами білка MamK, до якого ці мембранні міхурці кріпляться.[7][8]

FtsZ FtsZ (англ. filamenting temperature-sensitive mutant Z) — один із перший виявлених у прокаріот білок цитоскелету. Він наявний у клітинах фактично всіх досліджених бактерій та архей, а також у еукаріотичних органелах, що походять від прокаріот, зокрема пластидах.[1] Цей білок бере участь у формуванні Z-кільця, що забезпечує цитокінез під час поділу клітини. Крім FtsZ, у цьому процесі задіяна також велика кількість допоміжних білків, зокрема тих, що беруть участь у синтезі клітинної стінки бактерій.

Мономери FtsZ формують in vitro протофіламенти, що складаються із одного ряду цих білків. Протофіламенти не об'єднуються у структури схожі до мікротрубочок, хоча інколи і спостерігається формування пучків або листів. FtsZ полімеризується у активній ГТФ-зв'язаній формі, проте, на відміну від тубуліну, цей білок зазвичай не гідролізує ГТФ після включення його до складу протофіламенту. Таким чином, на відміну від протофіламентів мікротрубочок, які майже повністю складаються із ГДФ-тубуліну, і тільки на кінцях мають кепи із ГТФ-тубуліну, у протофіламентах FtsZ співвідношення ГТФ-зв'язаних субодиниць до ГДФ-зв'язаних становить 80:20.

За певних умов у протофіламентах FtsZ може відбуватись гідроліз ГТФ, у такому випадку їх форма переважно змінюється від прямої до зігнутої, і відбувається дестабілізація полімеру, внаслідок чого він може розпадатись на мономери. Протофіламенти FtsZ є динамічними структурами, вони постійно обмінюються субодиницями із пулом вільних мономерів.[10]

Зліва: Схема будови Z-кільця та його ролі у забезпеченні цитокінезу бактерій. Z-кільце складається із коротких філаментів білка FtsZ, що перекриваються між собою. Справа: одна із моделей функціювання Z-кільця за механізмом «повторюваного стискання»: прямі протофіламенти FtsZ у ГТФ-зв'язаній формі приєднуються до плазматичної мембрани за посередництва білка FtsA, після цього відбувається гідроліз ГТФ, протофіламенти переходять у викривлену ГДФ-зв'язану форму і стискають мембрану

Частина білка FtsZ у клітині бере участь у формуванні Z-кільця, тоді як решта перебуває у цитоплазмі у мономерній формі, або у формі коротких філаментів. Як було показано за допомогою флуоресцентної мікроскопії (із використанням мічених антитіл, або FtsZ злитого із GFP), Z-кільце добре помітне в центрі більшості клітин. Під час клітинного поділу воно скорочується, таким чином забезпечуючи цитокінез. Одночасно із зменшенням Z-кільця у материнській клітині, FtsZ починає полімеризуватись у центрі дочірніх клітин.

Z-кільце не складається із одного замкнутого у протофіламенту FtsZ, як показують численні дослідження, кількість мономерів FtsZ у Z-кільці достатня для того, щоб зробити приблизно 2,5 витків навколо внутрішнього діаметра клітини. Оскільки окремі протофіламенти FtsZ значно коротші за окружність клітини, була запропонована модель будови Z-кільця, згідно з якою воно складається із великої кількості коротких профіламентів, що перекриваються.[10] Ця модель була підтверджена даними отриманими за допомогою електронної кріотомографії.[11] Проте існують також і альтернативні моделі будови Z-кільця, одна з яких передбачає, що протофіламенти FtsZ взаємодіють кінець до кінця і утворюють неперервну спіраль.

Для забезпечення цитокінезу Z-кільце повинне якимось чином кріпитись до плазматичної мембрани. Цю роль у більшості бактерій виконує білок напівінтегральний білок FtsA та трансмембранний білок ZipA, цитоплазматичні домени яких кріпляться до FtsZ.

Механізм, за яким відбувається скорочення Z-кільця під час цитокінезу досі залишається не з'ясованим. Існувало кілька гіпотез, що описували ця вище:

• Модель ковзання: так як, швидше за все, Z-кільце складається із протофіламентів, що можуть взаємодіяти латерально, за аналогією до актину і міозину еукаріот, припускається, що існує певний моторний білок, який може забезпечувати ковзання цих протофіламентів один відносно одного. По мірі цього процесу також відбувається деполімеризація FtsZ, таким чином Z-кільце вкорочується і тягне плазматичну мембрану за собою. Головним недоліком цієї моделі є те, що ніяких таких моторних білків не було знайдено у жодного із видів бактерій.
• «Каркасна» модель: протофіламенти FtsZ можуть відігравати пасивну роль у цитокінезі. Згідно із цією моделлю вони тільки залучають ферменти синтезу клітинної стінки, до місця, де має відбутись цитокінез. Нові шари пептидоглікану, що відкладаються, забезпечують вгиннання плазматичної мембрани, через що і відбувається скорочення Z-кільця. Ця модель не в змозі пояснити механізму цитокінезу у мікобактерій, зокрема Mycobacterium tuberculosis, у яких пептидоглікан взагалі відсутній у клітинній стінці.
• Модель «повторюваного стиснення» — найбільш визнана в цей час. Цей механізм не передбачає участі якихось білків-моторів, а говорить про те, що протофіламенти FtsZ самі можуть генерувати силу, необхідну для цитокінезу. Вважається, що філаменти у складі Z-кільця приєднуються до цитоплазматичної мембрани у ГТФ-зв'язаній формі, в такому випадку вони мають пряму конформацію. Згодом в них відбувається гідроліз ГТФ, що призводить до згинання філаменту. Коли це відбувається, мебмрана клітини, приєднана до філаменту білками FtsA або ZipA, дещо вгинається. Таке послідовне стиснення мембрани і призводить до цитокінезу. Тільки останні його етапи не можуть відбуватись за таким механізмом, і можливо, проходять без участі білка FtsZ.[10][11]

Секвенування геномів багатьох бактерій дозволило виявити деякі тубуліноподібні білки відмінні від FtsZ. Зокрема, у бактерії Prosthebacter dejoneii були знайдені два білки BtubA та BtubB (англ. Bacterial tubulin), які є гомологами відповідно α та β тубуліну. Під час полімеризації у присутності ГТФ вони утворюють гетеродимери, як і α та β тубулін. Наразі функція цих білків невідома.

Цікаво, що ці білки за амінокіслитною послідовністю значно ближчі до еукаріотичних тубулінів, ніж до їх прокаріотичного гомолога FtsZ. Вважається, що бактерія P. dejoneii отримала гени цих білків внаслідок горизонтального перенесення від еукаріот.

Інший клас гомологів тубуліну був виявлений у великих плазмідах бактерій роду Bacillus, зокрема:

• Білок TubZ Bacillus thuringiensis, що кодується генами плазиди pBtoxis;
• Білок RepX закодований у плазміді pX01 Bacillus anthracis.

Обидва ці білки здатні утворювати довгі філаменти, внаслідок полімеризації у присутності ГТФ, і є необхідними для стабільного підтримання відповідної плазміди у клітині. Вони можуть брати участь у сегрегації копій плазмід, реплікації плазмід або в обох процесах.[9]

Схема осцилювання системи MinCDE.

Механізм осцилювання найкраще вивчений на прикладі системи MinCDE, до складу якої входить WACA MinD. Ця система необхідна клітині для того, щоб точно розмістити Z-кільце в центральній частині для правильного проходження цитокінезу. До її складу входять три білки:

• MinC — інгібітор полімеризації FtsZ;
• MinD — цитоскелетний білок WACA, що полімеризується на цитоплазматичній мембрані;
• MinE — білок, що стимулює гідролітичну активність MinD.

В E.coli ця система функціонує наступним чином: після приєднання молекули АТФ MinD полімеризується на плазматичній мембрані, утворюючи спіралі. У такій активованій формі він зв'язує білок MinC, через що у цьому конкретному місці пригнічується утворення Z-кільця. Також MinD-АТФ може взаємодіяти із MinE, що стимулює гідроліз АТФ, після цього інактивований MinD від'єднується від мембрани і може дисоціювати в інше місце. Дисоціює він переважно на протилежний полюс клітини, де нема білка MinE, там починається полімеризація нового комплексу, яка триває до тих пір, поки не закінчиться деполімеризація старого. А коли вона починає підходити до кінця, то білок MinE вивільняється і починає «руйнувати» новоутворений комплекс MinD/MinC. Таким чином цей комплекс «скаче» від одного полюсу до іншого із періодичністю 40-50 хв, і не зачіпає тільки центральну ділянку, в якій і відбувається утворення Z-кільця, оскільки там її нічого не пригнічує.[12]

Попри те, що MinD є дуже консервативним білком серед прокаріот, у різних видів він функціонує по-різному, наприклад у B.subtilis не відбувається осцилювання: MinD постійно приєднаний до клітинних полюсів за допомогою іншого білка DivIVA. Окрім того, бактерії мають «запасні» механізми просторового регулювання цитокінезу, які діють навіть за відсутності MinCDE, наприклад механізм «уникнення нуклеоїда»: формування Z-кільця пригнічується поблизу від нуклеоїда.

У деяких бактерій взагалі відсутня і система MinCDE і механізм «уникнення нуклеоїда», наприклад у C.crescentus місце проходження цитокінезу визначається за допомогою білка MipZ (що має схожість до ParA). Цей білок полімеризується поблизу точки ori і також пригнічує утворення Z-кільця.[12]