Сайленсинг генів

• Геномний імпринтинг
• Парамутація
• Сайленсинг транспозону (або модифікації Гістона)
• Трансгенний сайленсинг
• Позиційний ефект
• РНК-спрямоване метилювання ДНК

• РНК-інтерференція
• РНК-сайленсинг
• Нонсенс-опосередковане розпад

• Трансвекція
• Мейотичнй сайленсинг непарної ДНК

Антисенсові (антисмислові) олігонуклеотиди були відкриті в 1978 році Полем Замєчником та Мері Стівенсон.[5] Олігонуклеотиди, що представляють собою короткі фрагменти нуклеїнової кислоти, зв'язуються з комплементарними молекулами мРНК-мішені, коли їх додають до клітини[6]. Ці молекули можуть складатися з одноланцюгової ДНК або РНК і, як правило, мають довжину 13–25 нуклеотидів[7]. Антисенсові олігонуклеотиди можуть впливати на експресію генів двома способами: за допомогою механізму РНКаза H- залежного механізму або за допомогою стеричного блокувального механізму . РНКаза-Н-залежні олігонуклеотиди викликають деградацію молекул-мішеней мРНК, тоді як олігонуклеотиди стеричних блокаторів перешкоджають трансляції молекули мРНК . Більшість антисмислових лікарських препаратів функціонують через РНКаза H-залежний механізм, в якому РНКаза H гідролізує нитку РНК гетеродуплексу ДНК/РНК . Цей механізм вважається більш ефективним, що призводить до зниження експресії білка та мРНК приблизно на 80 % до 95 %.

Рибозими - це каталітичні молекули РНК, які пригнічують експресію генів . Ці молекули працюють, розщеплюючи молекули мРНК, по суті піддаючи сайленсингу гени, що їх продукували. Сідні Альтман та Томас Чех вперше виявили каталітичні молекули РНК, РНКазу Р та інтронні рибозими групи II, у 1989 році та отримали Нобелівську премію за своє відкриття[8][9]. Існує кілька типів мотивів рибозимів, серед яких молоток, шпилька, вірус гепатиту дельта, група I, група II і рибозими РНКази Р. Мотиви рибозиму молотка, шпильки та вірусу гепатиту дельта (HDV) зазвичай зустрічаються у вірусах або вірусних РНК . Ці мотиви здатні самостійно розщеплювати специфічний фосфодіефірний зв'язок на молекулі мРНК . Нижчі еукаріоти та деякі бактерії містять рибозими I та II групи. Ці мотиви можуть сплайсингуватися самі з собою, розщеплюючи та з'єднуючь між собою фосфодіефіріи зв'язми . Останній з наведених мотивів рибозиму — рибозим РНКази Р — знайдено у Escherichia coli, він відомий своєю здатністю розщеплювати фосфодіефірні зв'язки кількох попередників тРНК під час приєднання до білкового кофактора .

Ліворуч: Загальна схема РНК-інтерференції.

Інтерференція РНК (RNAi) — це природний процес, що використовується клітинами для регулювання експресії генів. Він був відкритий в 1998 році Ендрю Файром та Крейгом Мелло, які отримали за своє відкриття Нобелівську премію в 2006 році. Процес сайленсингу генів спочатку починається з надходження в клітину дволанцюгової молекули РНК (dsRNA), яка запускає шлях РНКі. Потім дволанцюгова молекула розрізається на невеликі дволанцюгові фрагменти ферментом, який називається Dicer . Ці невеликі фрагменти, які включають невеликі інтерферуючі РНК (siRNA) та мікроРНК (miRNA), мають довжину приблизно 21–23 нуклеотидів. Фрагменти інтегруються в мульти-субодиничний білок, який називається РНК-індукованим комплексом сайленсингу, який містить білки Аргонавта, які є основними компонентами шляху РНКі . Один ланцюг молекули, який називається «направляючим» ланцюгом, зв'язується з RISC, а інший, відомий як «пасажирський» ланцюг, деградує. Направляючий, або антисенсовий ланцюг фрагмента, що залишається зв'язаним з RISC, спрямовує специфічний щодо послідовності сайленсинг молекули цільової мРНК. Гени можна піддати сайленсингу молекулами siRNA, які викликають ендонуклеотичне розщеплення цільових молекул мРНК, або молекулами miРНК, які пригнічують трансляцію молекули мРНК. З розщепленням або трансляційною репресією молекул мРНК гени, що їх утворюють, робляться по суті неактивними. Вважається, що РНКі розвинувся як механізм захисту клітин від проникнення чужорідних організмів, таких як РНК-віруси, або для боротьби з розповсюдженням транспозонів у ДНК клітини . І РНК-віруси, і транспозони можуть існувати як дволанцюгові РНК і призводити до активації РНКі. В даний час siRNA широко використовуються для пригнічення специфічної експресії генів та оцінки функції генів. Компанії, що використовують цей підхід, включають Alnylam, Sanofi, Arrowhead, Discerna, та Persomics.

Три основні області, які не транслюються (3'UTR) матричних РНК (мРНК) часто містять регуляторні послідовності, які після транскрипції викликають сайленсинг генів. Такі 3'-UTR часто містять сайти зв'язування мікроРНК (miRNA), а також регуляторні білки. Зв'язуючи конкретні сайти в межах 3'-UTR, велика кількість специфічних міРНК знижує експресію генів своїх конкретних цільових мРНК шляхом інгібування трансляції, або безпосередньо викликаючи деградацію транскрипту, використовуючи механізм, подібний до інтерференції РНК (див. MicroRNA). 3'-UTR також може мати області сайленсера, які зв'язують репресорні білки, що інгібують експресію мРНК.

Методи сайленсингу генів широко використовуються дослідниками для вивчення генів, пов'язаних з хворобами. Ці розлади включають рак, інфекційні захворювання, респіраторні захворювання та нейродегенеративні розлади. В даний час генний сайленсинг також використовується в методах виявлення наркотиків, таких як синтетична летальність, високопродуктивний скринінг та мініатюрні екрани RNAi.

РНК-інтерференція використовується для сайленсингу генів, асоційованих з декількома видами раку. В in vitro дослідженнях хронічного мієлолейкозу (СМЛ) siРНК використовували для розщеплення злитого білка BCR-ABL, що перешкоджає зв'язку препарату Gleevec (іматиніб) з раковими клітинами[10]. Розщеплення злитого білку зменшувало кількість трансформованих кровотворних клітин, які поширюються по всьому організму за рахунок підвищення чутливості клітин до препарату . РНК-інтерференція може також використовуватися для націлювання на конкретні мутанти. Наприклад, siRNA були здатні специфічно зв'язуватися з молекулами супресору пухлини р53, що містять мутацію в одній точці, і знищувати її, залишаючи супресор дикого типу неушкодженим[11].

Вірусні гени та гени клітин-хазяїнів, необхідні вірусам для розмноження або потрапляння в клітину, або які відіграють важливу роль у життєвому циклі вірусу, часто є мішенями для противірусної терапії. RNAi використовувалися для націлювання генів на кілька вірусних захворювань, таких як вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) та гепатит[12][13]. Зокрема, siRNA була використана для замовчування первинного рецептора хемокінового рецептора ВІЛ 5 (CCR5)[14]. Це заважало вірусу потрапляти в лімфоцити периферичної крові людини та первинні гемопоетичні стовбурові клітини[15]. Подібна методика була використана для зменшення кількості виявленого вірусу в клітинах, інфікованих гепатитом В та С. При гепатиті В для сайленсингу поверхневого антигену вірусу гепатиту В використовували сайленсинг на основі siRNA, що призводило до зменшення кількості вірусних компонентів[16]. Крім того, методи siРНК, що застосовуються при гепатиті С, знижували кількість вірусу в клітині на 98 %[17][18].

Будова типової грампозитивної бактеріальної клітини

На відміну від вірусів, бактерії не так чутливі до замовчування siRNA[19]. Передусім це пов'язано з тим, як розмножуються бактерії. Бактерії розмножуються поза клітиною-господарем і не містять необхідних механізмів для функціонування РНКі . Однак бактеріальні інфекції все-таки можна піддати сайленсингу з використанням siRNA шляхом націлення на ген клітин-господарів, які беруть участь у імунній відповіді, викликаній інфекцією, або шляхом націлювання на ген клітин-господарів, які опосередковують потрапляння бактерій у клітини[20]. Наприклад, siRNA використовували для зменшення кількості протизапальних цитокінів, експресованих у клітинах мишей, оброблених ліпополісахаридом (LPS)[21]. Зниження експресії запального цитокіну, фактора некрозу пухлини α (TNFα), у свою чергу, спричинило зменшення септичного шоку, якого зазнавали миші, які отримували ЛПС . Крім того, siRNA була використана для запобігання потрапляння бактерій, Psueomonas aeruginosa, до епітеліальних клітин легенів миші шляхом нокдауну гена кавеоліну-2 (CAV2)[22]. Таким чином, хоча механізми siRNA не можуть бути безпосередньо націлені на бактерії, вони все одно можуть бути уражені siRNA, коли націлені компоненти, що беруть участь у бактеріальній інфекції.

Рибозими, антисмислові олігонуклеотиди та нещодавно РНКі використовувались для націлювання молекул мРНК, що беруть участь у розвитку астми[20][23]. Ці експерименти дозволили припустити, що siRNA можна використовувати для боротьби з іншими респіраторними захворюваннями, такими як хронічна обструктивна хвороба легень (ХОЗЛ) та муковісцидоз . ХОЗЛ характеризується гіперплазією келихоподібних клітин та гіперсекрецією слизу[24]. Виявлено, що секреція слизу знижується, якщо натрансформуючий фактор росту (TGF) -α націлити siRNA в епітеліальних клітинах NCI-H292 дихальних шляхів людини[25]. Крім гіперсекреції слизу, хронічне запалення та пошкоджена тканина легенів характерні для ХОЗЛ та астми. Вважається, що трансформуючий фактор росту TGF-β відіграє певну роль у цих проявах[26][27]. В результаті, коли інтерферон (IFN)-γ використовувався для нокдауну TGF-β, зменшувалися показникфіброзу легень, спричиненого пошкодженням та рубцюванням легеневої тканини[28][29].

Кристалографічна структура N-кінцевої області білка Гантінгтона людини.

Хвороба Гантінгтона (HD) є результатом мутації гена білку гантінгтіну, яка викликає надлишок повторів CAG[30]. Потім ген утворює мутований білок гантінгтін з поліглютаміном, що повторюється поблизу амінного кінця молекули[31]. Ця хвороба невиліковна і, як відомо, викликає руховий, когнітивний та поведінковий дефіцити[32]. Дослідники розглядали можливість сайленсингу генів як потенційного терапевтичного факту для ХГ.

Аміотрофічний латеральний склероз (АЛС), який також називають хворобою Лу Геріга, — це захворювання моторних нейронів, що вражає головний і спинний мозок. Захворювання призводить до переродження моторних нейронів, що врешті-решт веде до загибелі нейронів та м'язової дегенерації[33]. Було виявлено, що АЛС можуть спричиняти сотні мутацій гена супероксиддисмутази Cu/Zn (SOD1)[34]. Сайленсинг генів використовували для нокдауну мутованої форми SOD1, характерного для АЛС[35]. Зокрема, молекули siRNA успішно використовуються для націлення на мутантний ген SOD1 та зменшення його експресії за рахунок алель-специфічного сайленсингу гена[36].

Основний механізм, який використовують вірусні вектори для доставки генів до клітин-мішеней. Показаний приклад — лентивірусний вектор.

Існує кілька проблем, пов'язаних із терапією на основі сайленсингу генів, включаючи доставку до цільових клітин та їхню специфіку. Наприклад, для лікування нейродегенеративних порушень молекули для сайленсинг-терапії повинні надходити до мозку. Гематоенцефалічний бар'єр ускладнює доставку молекул до мозку через кров, запобігаючи проходженню більшості молекул, які вводяться в кров[30][31]. Таким чином, дослідники виявили, що вони повинні безпосередньо вводити молекули у мозок або застосовувати спеціальні імплантовані помпи.

Арктичні яблука — це набір торговельних марок[37] які містять ознаку відсутності побуріння тканин, створену за допомогою сайленсингу генів, які відповідають за експресію поліфенолоксидази (ПФО). Це перший затверджений харчовий продукт, у якому застосовано цю технологію[38].